Genome Editing Grundschema 2

CRISPR, TALEN & Co: Neue Züchtungsverfahren in der Übersicht

Eine Reihe neuer molekularbiologische Verfahren findet zunehmend auch in Pflanzenforschung und -züchtung Anwendung. In der Regel sind sie viel genauer und präziser - sowohl verglichen mit der klassischen Gentechnik als auch mit herkömmlichen Züchtungsmethoden. Anders als bei der Gentechnik werden nicht mehr „fremde“ Gene von außen eingeführt, sondern einzelne, in einer Pflanze vorhandene DNA-Bausteine gezielt entfernt oder modifiziert.

Bisher ist es in der EU noch nicht abschließend geklärt, ob mit diesen Verfahren „umgeschriebene“ Pflanzen nach den aktuellen gesetzlichen Definitionen als „gentechnisch verändert“ anzusehen sind oder nicht. Einige der Verfahren können als gezielt gesteuerte Mutationen aufgefasst werden, die in den Gentechnik-Gesetzen ausdrücklich ausgenommen sind. Andere sind eher mit der Gentechnik vergleichbar oder liegen irgendwo dazwischen.

ODM Olegonukleotid gerichtete Mutation

Oligonukleotid gerichtete Mutagenese (ODM)

Was?
Molekularbiologische Methode, um gezielt Mutationen im Genom hervorzurufen.

Wie?
Kurze DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) werden synthetisch hergestellt und mit verschiedenen Verfahren in die Zelle eingeführt. Dort lösen sie an einer bestimmten Stelle im Genom eine Mutation aus, welche nur ein oder einige wenige Basenpaare betrifft.

Nachweis
Pflanzen, bei deren Züchtung ODM eingesetzt wurde, sind nicht von anderen natürlichen Pflanzen unterscheidbar. Ein verfahrensspezifischer Nachweis ist daher nicht möglich.

GVO?
Empfehlungen wissenschaftlicher Kommissionen (ZKBS, EFSA): ODM ist als Mutagenese einzustufen. Nach den aktuellen GVO-Definitionen sind damit entstandene Pflanzen daher nicht als „gentechnisch verändert“ anzusehen. - Die Olegonukleotide wirken wie Mutagene und rufen Mutationen hervor, die von spontanen „natürlichen“ Mutationen nicht unterscheidbar sind.

Stand
ODM wird in der Züchtung eingesetzt, etwa bei Raps, Mais, Weizen, Reis oder Banane. Es können ähnliche Merkmale (Resistenzen gegen Schädlinge und Krankheiten, Herbizidtoleranz, Toleranz gegen abiotischen Stress, veränderte Stärke- und Fettsäurezusammensetzung) in Pflanzen eingebracht werden wie mit gentechnischen Verfahren. - Erste mit ODM gezüchtete Sorten sind zumindest in Nordamerika auf dem Markt.

Genome Editing 2

Genome Editing ist der Sammelbegriff für verschiedene Verfahren, etwa CRISPR/Cas, TALEN, ZFN

CRISPR Cas9
Genome editing Rekombination

CRISPR/Cas-System (oben), homologe und nicht-homologe Rekombination zu Veränderung von DNA an Doppelstrangbrüchen (unten)

CRISPR/Cas-System

Was?
Neue, molekularbiologische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern. Gene können eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden. Ursprünglich stammt das System aus Bakterien und ist eine Art Immunsystem, mit dem sich Bakterien gegen Angriffe von Viren wehren.

Wie?
Mit dem CRISPR/Cas-System kann man wie mit den anderen Genome Editing-Verfahren punktgenau doppelsträngige DNA schneiden, um an dieser Stelle neue DNA-Bausteine einzufügen, zu entfernen oder zu modifizieren. Als Sonde für die jeweilige Zielsequenz dient eine dazu passende RNA, an die das Schneideprotein Cas9 gekoppelt ist. Inzwischen stehen weitere solcher Proteine mit einer noch größeren Zielgenauigkeit zur Verfügung. Im Vergleich zu den anderen Verfahren lässt sich das CRISPR/Cas-System viel einfacher, schneller und kostengünstiger herstellen.

Nachweis
Werden keine neuen Gene oder größere DNA-Abschnitte in das Erbgut eingefügt, sind mit dem CRISPR/Cas-System erzeugte Pflanzen (bzw. deren Nachkommen) in der Regel nicht von anderen natürlichen oder herkömmlich gezüchteten unterscheidbar. Ein verfahrensspezifischer Nachweis ist dann nicht möglich.

GVO?
Es ist noch unklar, ob unter Verwendung des CRISPR/Cas-Systems gezüchtete Pflanzensorten als gentechnisch veränderte Organismen einzustufen sind. Einige Länder außerhalb der EU haben sich für ein differenziertes fallweises Vorgehen entschieden.

Stand
Bisher wird CRISPR/Cas vor allem in der Forschung eingesetzt, um Erkenntnisse über die Funktionalität bestimmer Gene zu erhalten. Verglichen mit anderen Genome Editing-Verfahren hat CRSISPR/Cas viele Vorteile: Es ist präziser, einfacher und deutlich kostengünstiger. Experten sehen daher ein großes Potenzial auch für die praktische Pflanzenzüchtung.

Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)

Was?
Molekularbiologische Methode mit künstlich hergestellten Enzymen, um DNA zielgerichtet zu schneiden und zu verändern. Dabei können kleine DNA-Abschnitte eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden.

ZFN Zinkfinger Nukleasen

Wie? Zinkfinger-Nukleasen bestehen aus zwei Elementen: Eines (Zinkfinger-Protein) kann eine ganz bestimmte DNA-Sequenz im Erbgut erkennen und dort andocken. Ein zweites (Nukleasen) schneidet an dieser Stelle beide DNA-Stränge (Doppelstrangbruch). Der Bruch wird durch das zelleigene Reparatursystem wieder zusammengefügt. Dabei treten Mutationen auf, die gezielt gelenkt werden können. - Es gibt verschiedene Varianten der ZFN-Technik.
ZNF-1: Das zelleigene Reparatursystem wird nicht beeinflusst. Beim Zusammenfügen des Bruchs entstehen an dieser Stelle Mutationen.
ZFN-2: Es werden zusätzlich kurze DNA-Abschnitte eingeführt, die zu den Bruchkanten im DNA-Strang passen. Sie dienen als „Vorlage“ für das Reparatursystem. Dadurch können Mutationen gezielt herbeigeführt werden.
ZFN-3: Es werden längere DNA-Abschnitte eingeführt, diese werden dann bei der Reparatur der Schnittstelle in das Erbgut eingebaut.

Nachweis
Mit ZFN-1/ZFN-2 gezüchtete Pflanze sind nicht von anderen natürlichen oder herkömmlich gezüchteten Pflanzen unterscheidbar. Ein verfahrensspezifischer Nachweis ist daher nicht möglich. - Werden mit Hilfe der ZFN-3-Technik neue Gene eingeführt, sind diese Pflanzen von anderen unterscheidbar.

GVO?
Empfehlungen wissenschaftlicher Kommissionen (ZKBS): Bei ZFN-1 und ZFN-2 entsteht kein GVO. Durch die ZFN werden auf Dauer keine neuen Gene oder Genkonstrukte in das Erbgut der Pflanzenzelle eingebaut. Die aus einer ZFN-behandelen Zelle hervorgehenden Nachkommen besitzen Mutationen, die von spontanen Mutationen oder solchen, wie sie bei der Mutationszüchtung entstehen, nicht unterscheidbar sind. Wird jedoch mit der ZFN-3-Technik rekombinante DNA in das Erdgut eingebaut, sind diese Organismen gentechnisch verändert.

Stand
ZFN wird in der Züchtung (Raps, Soja, Mais, Tomate, Tabak) eingesetzt. Erste Produkte werden in ein bis zwei Jahren auf den Markt kommen. }}}

TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)

Was?
Molekularbiologische Methode mit künstlich hergestellten Enzymen, um DNA zielgerichtet zu schneiden und zu verändern. Dabei können Gene eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden.

TALEN

Wie?
Ähnlich wie die ZFN erfüllen auch TALEN zwei Funktionen: Sie werden so konstruiert, dass sie eine ganz bestimmte Zielsequenz im Erbgut erkennen und dort den DNA-Strang schneiden. Dadurch können gezielt Gene entfernt (Knockout) oder mit Hilfe des zelleigenen Reparatursystems modifiziert werden.

Nachweis
Werden keine neuen Gene oder größere DNA-Abschnitte in das Erbgut eingefügt, sind die mit TALEN modifizierten Pflanzen (bzw. deren Nachkommen) in der Regel nicht von anderen natürlichen oder herkömmlich gezüchteten unterscheidbar. Ein verfahrensspezifischer Nachweis ist dann nicht möglich.

GVO?
Bisher ist noch nicht abschließend geklärt, ob Pflanzen, welche unter Verwendung von TALENs gezüchtet werden, als gentechnisch veränderte Organismen einzustufen sind. Vermutlich wird es wie bei CRISPR/Cas und ZFN-Technik davon abhängen, ob neue Gene eingeführt und in das Erbgut integriert worden sind.

Stand
Bisher steht die Anwendung dieses Verfahrens in der Pflanzenzüchtung noch am Anfang. Wie ZFN wird vermutlich auch TALEN als Genome Editing-Verfahren in der Pflanzenzüchtung gegenüber CRISPR/Cas eine nachrangigere Rolle spielen.

Pfropfen

Pfropfen

Was?
Kombination klassischer Pfropftechnik mit der Gentechnik. Pfropfen wird bei Zier- und Obstbäumen, aber auch bei einigen Gemüse- und Blumenarten angewendet.

Wie?
Zu unterscheiden sind zwei Ansätze:
(1) Ein Wurzelstock wird gentechnisch verändert, um den Wurzelstock selbst mit neuen oder verbesserten Eigenschaften zu versehen (z.B. Resistenzen gegen bodenbürtige Krankheiten, veränderte Bewurzelung). Auf diesen Wurzelstock wird ein herkömmlicher Reiser gepflanzt. (2) Der Wurzelstock wird mit verschiedenen gentechnischen Verfahren so verändert, dass er Proteine oder RNAi bildet, die in den Reiser transportiert werden und ihn in gewünschter Weise verändern.

Nachweis
Chimären aus gv-Wurzelstock und aufgepfropftem herkömmlichen Reiser lassen sich identifizieren, nicht aber deren Nachkommen und Ernteprodukte, da sie keine durch das Verfahren geänderte DNA-Sequenzen besitzen.

GVO?
Chimären - also die gesamte Pflanze - aus gv-Wurzelstock und aufgepfropftem herkömmlichen Reiser gelten als GVO. Freisetzungen und Anbau solcher Pflanzen müssten nach dem Gentechnik-Recht zugelassen werden. Das Erbgut des Reisers ist jedoch nicht gentechnisch verändert. Das trifft auch für Nachkommen und Ernteprodukte (etwa Früchte) zu, sofern sie direkt vom Reiser und nicht vom Wurzelstock abstammen. Sie müsssten also weder als Lebensmittelzugelassen, noch gekennzeichnet werden.

Stand
Die Entwicklung gentechnisch veränderter Wurzelstöcke (1)ist bei verschiedenen Baumarten weit fortgeschritten. Entsprechende Chimären werden bereits im Freiland getestet. Mit kommerziellen Anwendungen wird in etwa fünf Jahren gerechnet. Der Ansatz (2), über einen entsprechend veränderten Wurzelstock den Reiser zu beeinflussen, wird derzeit an Modellpflanzen untersucht. Anwendungen sind allenfalls langfristig zu erwarten.

Agroinfiltration

Was?
Verfahren, bei dem rekombinante Agrobakterien genutzt werden, um in Pflanzen eine vorübergehende (transiente Expression von Genen zu erreichen.

Wie?
Gewebe von Pflanzen, meist Blätter, wird mit der Suspension von Agrobakterien infiltriert. Mit den Agrobakterien wird ein Genkonstrukt in die Zelle transportiert. Die Expression dieser Gene ist lokal auf das infizierte Gewebe begrenzt. Dabei kann ein Protein gebildet oder auch ein bestimmtes Gen blockiert werden. Das Genkonstrukt wird so konstruiert, dass es nicht dauerhaft in das Erbgut der Pflanze integriert wird.

Nachweis
Samen, Nachkommen oder Früchte von mit Agroinfiltration behandelten Pflanzen enthalten keine neu eingeführte DNA und sind daher nicht von herkömmlichen Produkten unterscheidbar.

GVO?
Die Agrobakterien gelten als GVO und unterliegen daher den gesetzlichen Sicherheitsbestimmungen (S1-Labor). Sofern Pflanzen (und nicht abgeschnittene Pflanzenteile) mit Agrobakterien infiziert werden, sind diese selbst nicht gentechnisch verändert, enthalten aber gv-Agrobaktreien. Der Status solcher Chimären ist nicht geklärt. - Nachkommen dieser Pflanzen, Samen oder Stecklinge gelten nicht als GVO, sofern sie keine Agrobakterien enthalten.

Stand
Die Agroinfiltration wird vor allem als Werkzeug in der Pflanzenzüchtung eingesetzt, um etwa einzelne Pflanzen darauf zu testen, ob sie gegen eine Krankheit oder Schaderreger resistent sind. Dadurch lassen sich Pflanzen identifizieren, die die gewünschte Resistenzreaktion zeigen. Diese werden für die Weiterzüchtung verwendet. Bei Raps, Kartoffeln und Kopfsalat soll Agroinfiltration bei Neuzüchtungen angewendet worden sein. Andere Anwendungen der Agroinfiltration (etwa Molecular Pharming) sind noch weit von praktischen Einsatzmöglichkeiten entfernt.

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