Genome Editing Grundschema 2

CRISPR, TALEN, Zinkfinger: Genome Editing im Überblick

Eine Reihe neuer molekularbiologische Verfahren findet zunehmend auch in Pflanzenforschung und -züchtung Anwendung. Gemessen an der klassischen Gentechnik wie auch an herkömmlicher Züchtung sind sie weitaus genauer, präziser und effizienter. Anders als bei der Gentechnik werden nicht mehr „fremde“ Gene von außen eingeführt, sondern einzelne, in einer Pflanze vorhandene DNA-Bausteine gezielt entfernt oder „umgeschrieben“.

Die verschiedenen Verfahren werden meist als Genome Editing (oder Gene Editing) bezeichnet, manchmal auch „Gen-Schere“ oder „Gen-Chirurgie“. Im Kern bestehen alle Genome Editing-Verfahren aus drei Schritten: :

Genome Editing 2

Genome Editing ist der Sammelbegriff für verschiedene Verfahren, etwa CRISPR/Cas, TALEN oder Zinkfinger-Nukleasen.

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(1) Finden: Zunächst muss im riesigen Genom einer Pflanze – das oft aus Milliarden Basenpaaren (DNA-Bausteine) besteht – genau die Stelle gefunden und angesteuert werden, bei der eine Änderung durchgeführt werden soll. Dazu werden im Labor „Sonden“ konstruiert, die genau zu der jeweiligen Ziel-Sequenz passen.

(2) Schneiden: Genau an der jeweiligen Zielsequenz – und nur da – wird der DNA-Strang mit einer molekularen „Schere“ – meist ein Protein - geschnitten. Beide Elemente – „Sonde“ und „Schere“ - sind zuvor in die Pflanzenzelle eingeführt worden

(3) Reparieren: Der an der jeweiligen Stelle herbeigeführte DNA-Doppelstrangbruch wird nun durch zelleigene Reparaturmechanismen wieder „geflickt“. Wie bei einer natürlichen Mutation können bei der Reparatur kleine Fehler entstehen, so dass das betreffende Gen nicht mehr abgelesen werden kann. Möglich ist aber auch, bei der Reparatur einzelne DNA-Bausteine umzuschreiben oder an der Schnittstelle neue DNA-Stücke einzufügen.

Wenn auf diese Weise ein bestimmtes Pflanzenmerkmal geändert oder zu optimiert werden soll, müssen die zu editierenden Gene und ihre Funktion vollständig bekannt sein. Die Wissenschaftler müssen ihr Ziel und den Ort im Erbgut ganz genau kennen – und wissen, was und wie sie dort „umschreiben“ wollen. Das erfordert viel Genomforschung und ein genaues Wissen über die molekularbiologischen Prozesse in der Pflanzenzelle.

CRISPR Cas9
Genome editing Rekombination

CRISPR/Cas-System (oben), homologe und nicht-homologe Rekombination zu Veränderung von DNA an Doppelstrangbrüchen (unten)

CRISPR/Cas-System

Was?
Neue, molekularbiologische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern. Gene können eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden. Ursprünglich stammt das System aus Bakterien und ist eine Art Immunsystem, mit dem sich Bakterien gegen Angriffe von Viren wehren.

Wie?
Mit dem CRISPR/Cas-System kann man wie mit allen Genome Editing-Verfahren punktgenau doppelsträngige DNA schneiden, um an dieser Stelle neue DNA-Bausteine einzufügen, zu entfernen oder zu modifizieren. Als Sonde für die jeweilige Zielsequenz dient eine dazu passende RNA, an die das Schneideprotein Cas9 gekoppelt ist. Inzwischen stehen weitere solcher Proteine mit einer noch größeren Zielgenauigkeit zur Verfügung.

Stand
Bisher wird CRISPR/Cas in der Pflanzenforschung vor allem eingesetzt, um einzelne Gene punktuell zu verändern oder abzuschalten. Verglichen mit anderen Genome Editing-Verfahren hat CRSISPR/Cas viele Vorteile: Es ist präziser, einfacher und deutlich kostengünstiger. Experten sehen daher ein großes Potenzial auch für die praktische Pflanzenzüchtung. Inzwischen sind eine Vielzahl von Projekten an zahlreichen Pflanzenarten publiziert. Erste CRSISPR-editierte Pflanzen werden bereits im Freiland getestet, in den USA stehen erste Markteinführungen bevor.

ZFN Zinkfinger Nukleasen

Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)

Was?
Molekularbiologische Methode mit künstlich hergestellten Enzymen, um DNA zielgerichtet zu schneiden und zu verändern. Dabei können kleine DNA-Abschnitte eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden.

Wie? Zinkfinger-Nukleasen bestehen aus zwei Elementen: Eines (Zinkfinger-Protein) kann eine ganz bestimmte DNA-Sequenz im Erbgut erkennen und dort andocken. Ein zweites (Nukleasen) schneidet an dieser Stelle beide DNA-Stränge (Doppelstrangbruch). Der Bruch wird durch das zelleigene Reparatursystem wieder zusammengefügt. Dabei treten an dieser Stelle Mutationen auf. Diese können zufällig sein, es ist aber auch möglich, sie gezielt zu lenken.

Stand
ZFN wird in der Züchtung (z.B. Raps, Soja, Mais, Tomate, Tabak) eingesetzt. Erste Produkte stehen vor der Markteinführung.

TALEN

TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)

Was?
Molekularbiologische Methode mit künstlich hergestellten Enzymen, um DNA zielgerichtet zu schneiden und zu verändern. Dabei können Gene eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden.

Wie?
Ähnlich wie die ZFN erfüllen auch TALEN zwei Funktionen: Sie werden so konstruiert, dass sie eine ganz bestimmte Zielsequenz im Erbgut erkennen und dort den DNA-Strang schneiden. Dadurch können gezielt Gene entfernt (Knockout) oder mit Hilfe des zelleigenen Reparatursystems modifiziert werden.

Stand
Mehrere Pflanzen, die mit TALEN gezüchtet wurden (z.B. Sojabohne, Mais, Kartoffeln, Luzerne), befinden sich in den USA kurz vor der Markteinführung. Weitere Projekte mit TALEN sind publiziert.

ODM Olegonukleotid gerichtete Mutation

Oligonukleotid gerichtete Mutagenese (ODM)

Was?
Molekularbiologische Methode, um gezielt Mutationen im Genom hervorzurufen.

Wie?
Kurze DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) werden synthetisch hergestellt und mit verschiedenen Verfahren in die Zelle eingeführt. An einer bestimmten Stelle im Genom durchtrennen sie den DNA-Strang. Bei der anschließenden Reparatur werden an der Bruchstelle einzelne Basenpaare ausgetauscht oder verändert - im Prinzip der gleiche Vorgang wie bei jeder natürlichen Mutation aus. Unter den zufälligen DNA-Veränderungen an der Bruchstelle muss nun diejenige herausgefunden werden, die dem jeweiligen Züchtungsziel entspricht.

Stand
ODM wird in der Züchtung eingesetzt, etwa bei Raps, Mais, Weizen, Reis oder Banane. Es können ähnliche Merkmale (Resistenzen gegen Schädlinge und Krankheiten, Herbizidtoleranz, Toleranz gegen abiotischen Stress, veränderte Stärke- und Fettsäurezusammensetzung) in Pflanzen eingebracht werden wie mit gentechnischen Verfahren. Erste mit ODM gezüchtete Sorten sind in Nordamerika auf dem Markt.

Nachweis: Kann man eine editierte Pflanze von einer natürlich vorkommenden unterscheiden?

Mit den heutigen molekularbiologischen Analyseverfahren ist es inzwischen möglich, genetische Unterschiede zwischen einzelnen individuellen Organismen - etwa Pflanzen - relativ einfach und zuverlässig nachzuweisen. In aller Regel ist aber nicht eindeutig festzustellen, worauf die jeweiligen genetischen Unterschiede zurückzuführen sind - ob auf eine zufällige, natürliche Mutation, Genome Editing oder andere Züchtungsverfahren. Sind wie in den meisten Fällen keine Fremdgene oder anderes eingeführtes Genmaterial mehr vorhanden, ist eine editierte Pflanze von anderen analytisch nicht unterscheidbar.

Eine Rückverfolgbarkeit von editierten Pflanzen über die gesamte Verarbeitungskette wäre nur durch ergänzende Informationen möglich, nicht aber durch eine analytische Nachweisbarkeit der betreffenden Pflanze. Das trifft auf alle Genome Editing-Verfahren zu.

Ist eine Pflanze, die mit Genome-Editing verändert wurde, gentechnisch verändert?

Bisher ist es international nicht einheitlich geklärt, ob editierte Pflanzen als gentechnisch veränderte Organismen GVO einzustufen sind. Die großen Agrarländern außerhalb der EU wollen differenziert und einzelfallbezogen vorgehen.

(1) Es wird eine gezielte Punktmutation ausgelöst. Über den zufällgen Austausch von DNA-Bausteinen an der Bruchstelle hinaus werden aktiv keine weiteren Änderungen der DNA durchgeführt.

(2) Es werden zusätzlich kurze DNA-Abschnitte eingeführt, die zu den Bruchkanten im DNA-Strang passen. Sie dienen als „Vorlage“ für das Reparatursystem. Auf diese Weise kann ein kurzes Stück DNA in die pflanzliche Erbinformation integriert werden, das nahezu identisch zur ursprünglichen Sequenz ist, aber sich nur in wenigen DNA-Bausteinen von dieser unterscheiden kann.

(3) Es werden längere DNA-Abschnitte - oder gar ein komplettes Gen - eingeführt. Diese werden dann bei der Reparatur der Schnittstelle dauerhaft in das Erbgut eingebaut.

Die erste Genome Editing-Variante - manchmal auch die zweite - werden außerhalb der EU meist als Mutationen eingestuft, die nicht unter die jeweilgen Gentechnik-Gesetze fallen. Das entspricht den Empfehlungen vieler wissenschaftlicher Kommissionen und Vereinigungen. Dagegen führt die dritte Variante in der Regel zu Pflanzen, die als GVO angesehen werden und entsprechend reguliert werden.

Die EU hat einen Sonderweg eingeschlagen. Im Juli 2018 entschied der Europäische Gerichtshof (EuGH), dass alle mit Genome Editing-Verfahren erzeugte Pflanzen unter die geltenden Gentechnik-Gesetze fallen. Ihre Verwendung, aber auch jede Freisetzung in die Umwelt müssen genehmigt werden, daraus hergestellte Lebens- und Futtermittel sind kennzeichnungspflichtig.